華銀康單細胞轉錄組項目送樣指導 | 單細胞篇
2023-05-11 閱讀數：3769
單細胞轉錄組測序平臺能實現高通量的細胞捕獲，能夠一次性分離、并標記500–10000個單細胞，從而獲得每個細胞的3’端的轉錄組信息。具有細胞通量高、建庫成本低、捕獲周期短等優勢。該技術主要用于細胞分型和標記因子的鑒定，從而實現對細胞群體的劃分與細胞群體間基因表達差異的檢測，此外該技術還可以預測細胞分化與研究發育軌跡，在當下疾病、免疫、腫瘤領域以及組織、器官、發育研究中發揮越來越重要的作用。迄今為止，研究的樣本類型已有來自腫瘤，干細胞，胚胎，神經系統等多個不同部位，理論上真核生物都能進行單細胞轉錄組測序。在樣本選擇好之后，實驗結果是否理想，很大程度取決于樣本的質量，下面是樣本準備以及推薦樣本量的介紹，供廣大科研工作者參考。
樣本類型以及處理運輸
1.組織樣本
1.1新鮮組織樣本
（新鮮組織包含實體腫瘤組織及其他病理組織），目前組織成功解離經驗包含組織如下：
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人 |
小鼠 |
大鼠 |
豬 |
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外周血 腎臟 肝臟 皮膚 肺 黃韌帶 乳腺（癌） 胰腺（癌） 骨髓 氣道組織 動脈瓣膜 結直腸（癌） 闌尾 胃黏膜 胃（癌）-原位和轉移灶 |
腦
腎臟
食道癌皮下組織
胰腺
肝臟
睪丸
坐骨神經
視網膜
股骨
脛骨 |
股骨 脛骨 坐骨神經 腎臟 肝臟
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卵巢
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（以上表格中組織可直接聯系實驗員送樣，不在上表中的其他送樣組織，如果不了解組織特性，請咨詢相關人員）
組織樣本要求：大于0.2g實體瘤組織，保護液能完全浸沒組織為宜，如樣本量足夠建議首次寄送時同一樣本2~3管重復。收到組織保存液后，及時使用，以免過保：將適量樣本用無菌生理鹽水清洗干凈血漬后，放入裝有組織保存液的儲存管中，迅速蓋緊加封口膜包裝好；無菌操作：操作過程遵循無菌操作，樣本污染可能會對后續數據質量造成嚴重影響，一定注意無菌操作。
樣品包裝：樣本運輸環境為 2-8℃，可冰袋寄送（注意不要選擇干冰），裝有樣本的儲存管不能和冰袋直接接觸，需用泡沫填充或包裹間隔，只有碎冰和冰水混合物樣本管可以接觸。
樣本寄送：樣本保存液對新鮮樣本的保存時間為 2-8℃，48小時，務必保證在48小時內到達實驗室。如銷售協助樣本運輸，可將樣本管插入碎冰運輸，請盡量保證樣本在當天下午3: 00前送達，當天解離細胞并開展實驗；當天未能送達的，次日解離細胞并開展實驗。請盡量保證樣本在工作日送達；如不能保證樣本在48小時內送達的，請銷售和客戶、實驗人員商議，滿足現場解離條件的，可協調現場解離上機或凍存。
1.2冰凍組織樣本
凍存樣本寄送建議:
（1） 樣本凍存：建議組織剪成1~2mm3，0.2~0.5g/管為宜；將取下的樣本直接放入液氮速凍，不需要清洗，然后-80℃保存；
（2） 樣本寄送：如樣本量足夠建議首次寄送時同一樣本2~3管重復，以防萬一；樣品做好標記，隨樣本寄送《單細胞送樣信息表》，建議干冰用量15~20公斤（夏季可以適度增加）。
細胞樣本
2.1貼壁細胞
樣本要求：從培養箱中取出細胞培養瓶或培養板，顯微鏡下觀察細胞，確定生長狀態良好且無污染；倒棄培養基，向細胞培養瓶或培養皿中加入適量預冷的PBS，洗2次；棄盡PBS，加入適量相應的消化酶進行消化，利用完全培養基終止反應；細胞計數，按照 1×106個細胞每管進行分裝，準確標記后將分裝好的細胞500g，4℃離心5min，棄掉上清。樣本保存與梯度凍存：
（1）組織保存液保存（適用于短時間運輸）：每管細胞用1 mL組織保存液重懸細胞，輕輕吹打混勻，封口膜封口；
（2）梯度凍存（適用于長時間運輸）：每管細胞用1mL預冷細胞凍存液（高糖DMEM牛血清：DMSO=7: 2: 1） 重懸細胞，輕輕吹打混勻，轉移至細胞凍存管內，封口膜封口；將裝有細胞的凍存管放入裝有異丙醇的梯度凍存盒中，再將凍存盒放入-80℃冰箱凍存凝固。（凍存盒的凍存速度接近每分鐘1℃，這樣計算的話，從25℃降到-80℃，要2小時凍存完成）
沒有梯度凍存盒的話，在冰箱里梯度降溫：先4℃ 10min，后-20℃ 30min，最后轉移至-80℃冰箱內過夜，過夜后，可將細胞轉移至液氮中保存；
（3）為確保實驗的順利，建議樣本備份1-2份，1×106個/份，以防備部分樣品降解重新取材，制備或送樣，耽誤時間。樣本量：3×104到1×106個活細胞（細胞活性大于80%）。（4）運輸方式：使用組織保存液保存的細胞樣本，冰袋或碎冰運輸，建議取樣后24小時內送達實驗室；使用梯度凍存的細胞樣本，將凍存管置于密封好的塑料袋中，并在泡沫盒中裝入足量的干冰進行運輸
注：凍存會影響細胞活性和實驗成功率；建議取樣后盡快送樣，非必要不進行凍存，以保證細胞活性。
2.2懸浮細胞
樣本要求：確定細胞生長狀態良好且無污染；細胞計數，按照 1×106個細胞每管進行分裝，準確標記后將分裝好的細胞500g，4℃離心5min，棄掉上清；加入500μL預冷PBS洗滌，500g，4℃離心5min，棄掉上清；
樣本保存與梯度凍存：
（1）組織保存液保存（適用于短時間運輸）：每管細胞用1mL組織保存液重懸細胞，輕輕吹打混勻，封口膜封口；
（2）梯度凍存（適用于長時間運輸）：每管細胞用1mL預冷細胞凍存液（高糖DMEM牛血清：DMSO=7: 2: 1） 重懸細胞，輕輕吹打混勻，轉移至細胞凍存管內，封口膜封口；將裝有細胞的凍存管放入裝有異丙醇的梯度凍存盒中，再將凍存盒放入-80℃冰箱凍存凝固。（凍存盒的凍存速度接近每分鐘1℃，這樣計算的話，從25 ℃降到-80℃，要2小時凍存完成）。
沒有梯度凍存盒的話，在冰箱里梯度降溫：先4℃ 10min，后-20℃ 30min，最后轉移至-80℃冰箱內過夜，過夜后，可將細胞轉移至液氮中保存；
（3）為確保實驗的順利，建議樣本備份1-2份，1×106個/份，以防備部分樣品降解重新取材，制備或送樣，耽誤時間。樣本量：3×104到1×106個活細胞（細胞活性大于80%）
（4）運輸方式：使用組織保存液保存的細胞樣本，冰袋或碎冰運輸，建議取樣后24小時內送達實驗室；使用梯度凍存的細胞樣本，將凍存管置于密封好的塑料袋中，并在泡沫盒中裝入足量的干冰進行運輸。
樣本類型以及處理運輸
血液樣本對樣本實效性要求最高，需要在采集樣品后數小時內完成樣本的細胞分離和處理，主要分離和富集PBMCs，并可能涉及單細胞多個組學產品的聯合應用（如轉錄組、細胞表面蛋白Panel、TCR/BCR 等）；血液樣本的制備需要提前和客戶確定好方案，詢產品經理和實驗人員確定好采血量、分離方案、篩選方案等，再行樣品準備。
血液樣本寄送建議：
（1） 客戶確定方案后，確定采血量，用抗凝管進行采樣，建議使用枸緣酸鈉的抗凝管（金黃色蓋，最優）或EDTA抗凝管（紫色蓋）采集血樣，采樣后輕輕顛倒管身數次，室溫平放 5 分鐘，期間可輕搖管身，避免劇烈搖晃造成凝血；室溫2小時內送達或加等體積常溫1xPBS，輕輕混勻，室溫2小時內送達；
（2） 如需要進行細胞分選、分離粒細胞、或從其他組織內（如肝臟、脾臟、骨髓等）分離單核細胞，或需要開展多個組學的研究，需提前溝通，確定實驗方案、特殊試劑貨期（如Panel 抗體），再行安排樣品采集；
（3） 血液樣本采樣前，需要提前至少一天和實驗人員預約；
（4） 采血量建議：單一組學建議每個樣本采血2-3mL（有條件可多采一份備份使用），可獲得百萬級的PBMCs；如果涉及2個以上組學或需要多樣本SMK標記的，建議5mL以上；如果涉及細胞分選，需根據標的細胞占比和數量確定采血量或咨詢相關人員；需要檢測組織內免疫細胞的可根據組織內免疫細胞文獻數據適當提高解離組織用量。
高通量測序檢測中心
中心定位于科研服務與臨床醫學轉化應用，圍繞基礎科研和臨床檢測兩大板塊，致力于生物醫學各領域的相關研究與測序大數據聯合分析，為各大高校、醫院和科研單位提供醫學科研項目的方案設計、測序實驗和數據分析為一體的一站式服務以及快速精準的臨床檢測服務，以成為業內領先的高通量測序服務中心為目標。
目前，我司高通量測序檢測中心擁有Illumina和MGI等高通量測序儀組成的大規模高通量測序服務平臺，科研服務可提供涵蓋基因組學、轉錄組學（外泌體）、表觀組學、單細胞組學、微生物組學、免疫組庫、代謝組學、蛋白組學和多組學關聯分析等組學基礎研究服務和高級生物信息分析；臨床服務包括遺傳性腎病基因檢測、血液腫瘤基因檢測、實體瘤基因檢測、感染性疾病病原體檢測等服務。
如需了解更多有關高通量測序相關信息，歡迎撥打我司高通量全國服務熱線：020-38917402、020-38917464
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